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汇总生物技术常用实验操作

发布时间:2022-03-09 点击量:501

一、总RNA的提取(Trizol法提取)
在收集到生物材料之后,最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存,则应以液氮将生物材料急速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时,将储存于冷冻柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破细胞,不可以先行解冻,以避免RNase的作用。

1.  提取组织RNA时,每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解;提取细胞RNA时,先离心沉淀细胞,每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞;
2.  将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟;
3.  在上述EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿,盖上EP管盖子,在手中用力震荡15秒,在室温下(15℃~30℃)放置2~3分钟后,12000g(2℃~8℃)离心15分钟;
4.  取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇,在室温下(15℃~30℃)放置10分钟,12000g(2℃~8℃)离心10分钟;
5.  弃上清,按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤,涡旋混合,7500g(2℃~8℃)离心5分钟,弃上清;
6.  让沉淀的RNA在室温下自然干燥;
7.  用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

二、琼脂糖核酸电泳
1.  用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净,放在制胶平板上,封闭模具边缘,架好梳子;
2.  根据欲分离DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶:准确称量琼脂糖干粉,加入到配胶用的三角烧瓶内,定量加入电泳缓冲液(一般20~30 ml);
3.  放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻,加入一滴荧光染料,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,待其凝固;
4.  室温下30~45分钟后凝胶*凝结,小心拔出梳子,将凝胶安放在电泳槽内;
5.  向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面1mm为宜,如样品孔内有气泡,应设法除去;
6.  在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液(loading buffer),混匀后,用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内;
7.  接通电源,红色为正极,黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60~100V电压,电泳20~40min即可;
8.  根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳;
9.  电泳完毕,关上电源,在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

琼脂糖凝胶浓度  线形DNA的最佳分辨范围(bp)
0.5%   1,000~30,000
0.7%   800~12,000
1.0%   500~10,000
1.2%   400~7,000
1.5%   200~3,000
2.0%   50~2,000

三、胶回收纯化DNA
1.  琼脂糖电泳,将特异电泳带用刀切下放入到EP管中,称琼脂糖带的重量;
2.  按照每100mg加400μl的量加入binding buffer,放入到EP管振荡器中,45℃~55℃温育振荡,直到所有的琼脂糖都溶解(大概要5分钟);
3.  取出纯化柱,将上述溶解液转移至柱中,室温下放置2分钟,8,000rpm 离心1分钟,弃EP管中的液体,将纯化柱放回EP管中;
4.  加500μl的wash buffer至柱中,8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液;
5.  重复操作4步的操作1次,最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒,除去痕量的wash buffer;
6.  将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40μl H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央,在37℃或50℃下放置2分钟,10,000rpm离心1分钟洗脱DNA,将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。
7.  注:若想要不电泳而直接纯化DNA溶液,只需要在第2步中按100μl液量加400μl的binding buffer,其余的步骤不变。