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传代细胞的传代方法及操作过程是什么?

发布时间:2018-12-05 点击量:2130

传代细胞的传代方法及操作过程实验原理传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或1:2以上的比例转移,接种到另一培养瓶的培养。

这种培养,

步也是制备细胞悬液,当细胞长成致密单层时,它很容易被蛋白水解酶和edta)所破坏。

所以—般采用胰蛋白酶和edta(乙二胺四乙酸盐)的混合物,做为消化液。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长,必须满足两个基本要求:

一是供给细胞存活所必需的条件,如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度,注意外环境酸碱度和渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。主要试剂l磷酸盐缓冲液(pbs)无钙、镁溶液细胞消化液:0.5%胰蛋白酶和0.4%edtaemem液3%谷氨酰胺0.5%台盘蓝染液等主要设备解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须*清洗、烤干、包装好,9.9xl04pa(15磅)灭菌30min备用。此外,还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。实验材料喉癌细胞实验步骤在做传代细胞培养之前,首先将培养瓶置于显微镜下,观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层,如已长成单层,即可进行细胞的传代培养。

1.营养液配制:emem液90%犊牛血清10%双抗(1万单位/m1)加至约100单位/m13%谷氛酞胺1m17.4%nahco3调ph至6.8—7.0

2.换液:在酒精灯旁打开瓶塞,倒去瓶中的细胞营养液。

3.消化与分装在上述瓶中加入1mledta溶液,轻轻摇动,将溶液倒出。重复上述动作。加入适量消化液(0.02%edta或0.04%edta1ml加0.5%胰蛋白酶液0.2ml)以盖满细胞为宜,置于室温,停留1—2min后,翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙),如出现缝隙,即可倒去消化液;如末出现缝隙,则可将瓶翻回,继续进行消化,直到出现缝隙为让。此时,可倒去消化液,加入新配制的营养液20m1。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液,反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时,可继续轻轻地吹打细胞悬液,以使细胞散开。随之进行分装。

4.培养分装好的细胞瓶上,做好标志,注明细胞代号、日期。置于培养架上,轻摇使细胞均匀分布,以免堆积成团。然后置于37℃培养。

5.观察1)观察体外培养细胞的几个问题;细胞培养24h后,即可进行观察,观察的重点如下:

a.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度

b.观察培养姬颜色变化及细胞是否生长。

c.如细胞已生长,则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照2)的描述进行。

d.观察完毕,可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。2)细胞的生长阶段及其形态特征传代培养的细胞需逐日进行观察,注意细胞有无污染,培养液颜色的变化及细胞生长的情况。—般中层培养的细胞,从培养开始,经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程,但为了观察及描述,人为地将具分为5个时期,但各期间无明显界限。现分别描述如下:

a.游离期:当细胞经消化分散成单个细胞后,由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以,此时细胞多为圆形,折光率高,此期可延续数h。

b.吸附期(贴壁):由于细胞的附壁持性,细胞悬液静置培养一段时间(约7—8h)后,便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞,如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点,大多立体感强,细胞内颗粒少,透明。

c.繁殖期:培养l2h以后直到72h,细胞进入繁殖期,加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群,常散在地分布在瓶壁上),到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点:透明,颗粒较少,细胞间界限清楚,并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率,又可将其生长状况分为四级。以“十”的多少表示如下:十:细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25%以内有新生细胞。一般要观察3—5个视野内的细胞生长状况,然后加以综合分析判断。十十:细胞占瓶壁有效面积的25—75%以内具新生细胞。细胞占瓶壁有效面积的75—95%具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。十十十十:细胞占瓶壁95%以上,细胞已长满或接近长满单层,细胞致密,透明度好。从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。

d.维持期:当细胞形成良好单层后,细胞的生长与分裂都减缓,并逐渐停止生长,这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊,细胞内颗粒逐渐增多,且透明度降低,立体感较差。由于代谢产物的不断积累,维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。e.衰退期:由于溶液中营养的减少和日龄的增长,以及代谢产物的累积等因素,此时细胞间可出现空隙,细胞中颗粒进一步增多,透明度更低,立体感很差。若将细胞经固定染色处理后,可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。后,细胞皱缩,逐渐死亡,从瓶壁上脱落下来。