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肝脏细胞培养过程详解

发布时间:2017-07-24 点击量:915
   肝脏是由肝脏细胞组成,肝细胞极小,肉眼看不到,必须通过显微镜才能看到。今天,我们给大家说说,如何培养肝脏细胞。

  肝细胞培养液的组成(以100ml培养液为例):DMEM90ml,10%胎牛血清10ml,肝细胞生长因子1-2ug,双抗(100乘)1ml,胰岛素500U/L、地塞米松0.4mg/L

  关于培养液添加内容的解释:

  肝脏细胞培养液中是否要添加肝细胞生长因子。重组人肝细胞生长因子(r—hHGF)是zui强的促肝细胞分裂剂,在一定剂量范围内,r—hHGF与肝细胞DNA的合成有明显的量效关系。

  肝脏细胞生长因子的剂量问题:1ng/ml r-hHGF即可引起DNA合成显著增加;10ng/ml时DNA合成效应zui大,继续增加r-hHGF的剂量会出现抑制效应。

  该实验结果可观察到,r-hHGF5ng/ml的刺激效应与10ng/ml的相差无几。这提示我们,为了节省试剂,在以后的实验中可采用5ng/ml的剂量。Strain等研究证明 ],从人血浆中提取并纯化的hHGF刺激原代培养大鼠肝细胞合成DNA的半zui大剂量为1—2 ng/ml(1O一20 pmol/L)

  肝细胞生长因子作用时间的问题;表现为r-hHGF作用24小时,DNA 合成量明显高于对照组(P<0.01),48小时作用达zui高(P<0.001),随后开始下降,至96小时下降到相当于24小时的水平。(肝细胞生长因子刺激大鼠离体肝细胞DNA合成的剂量一与时间一效应)

  胰岛素10-8mol/L,地塞米松10-6mol/L促进贴壁。

  青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml:防止污染。

  取肝脏细胞注意事项

  取大鼠肝脏细胞前需要禁食12h。非灌流分离肝细胞法,该法直接将离体肝脏置于冷的培养基中,切碎,加入溶解酶破换肝细胞间连结,再经过振动、沉淀,zui后在上清液中得到游离的肝细胞。(游离肝细胞培养技术在肝脏毒理学研究中的应用)

  洗涤液D-hanks液,用眼科剪剪成1mm3左右的碎块,使其成糊状。

  肝脏细胞培养过程中造成肝细胞损伤的问题

  原代培养的大鼠肝细胞的代谢功能较其他细胞更为敏感,本实验中由于肝细胞分离时细胞膜完整性的损伤,细胞需要在体外逐渐的修复,在培养第3天细胞活力(MTT实验A值zui大)达到高峰,合成和分泌功能完好,LDH漏出也较低,细胞达到*状态,与其他研究结果一致。(全反式视黄酸对大鼠原代肝细胞铁代谢的影响)